معلومة

هل يمكن فصل الارتباط والتحفيز الإنزيمى فى خطوتين؟

هل يمكن فصل الارتباط والتحفيز الإنزيمى فى خطوتين؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يمكن القيام بما يلي:

  1. يرتبط الإنزيم E بركائزه S بدون تحفيز ؛
  2. إضافة حافز يمكن التحكم فيه ، مثل الضوء أو إضافة أو إزالة المواد الكيميائية ؛
  3. يتم تحفيز التفاعل الأنزيمي بواسطة المنبه.

الكلمة يمكن السيطرة عليها يعني أنه يمكنني إضافة الحافز في أي وقت أريده. قبل أن أضيف المحفز ، يظل الإنزيم مرتبطًا بالركيزة على وجه التحديد ولكن لا يحدث أي تفاعل.

هذا ما أعنيه فصل الارتباط والتحفيز في خطوتين.

في حالة التنظيم الخيفي ، تمنع بعض المواد الكيميائية نشاط الإنزيم. على سبيل المثال ، سيثبط ATP نشاط إنزيم الفوسفوفركتوكيناز 1 (PFK1). لكنني لست متأكدًا مما إذا كان هذا التثبيط الخيفي يعيق أيضًا ارتباط PFK1 بالركيزة ، والتي لا تفي بالوصف أعلاه.


4.1: المبادئ الأساسية للحفز

  • بمساهمة كيفن أهيرن وإنديرا راجاجوبال وأمبير تارالين تان
  • أستاذ (الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية) في جامعة ولاية أوريغون

نسخة قابلة للطباعة من هذا القسم هنا: BiochemFFA_4_1.pdf. الكتاب الدراسي بأكمله متاح مجانًا من المؤلفين على http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

إذا كان هناك مكون سحري للحياة ، فمن المؤكد أنه يمكن إجراء حجة لكونه حافزًا. بفضل التحفيز ، يمكن أن تستغرق التفاعلات التي يمكن أن تستغرق مئات السنين لتكتمل في العالم غير المحفز وغير المحفز ، & rdquo تحدث في ثوانٍ في وجود عامل حفاز. يمكن للمحفزات الكيميائية ، مثل البلاتين ، تسريع التفاعلات ، لكن الإنزيمات (التي هي ببساطة محفزات فائقة مع & ldquotwist ، & rdquo كما سنرى) تضع المحفزات الكيميائية في العار (الشكل 4.1). لفهم التحفيز الإنزيمي ، من الضروري أولاً فهم الطاقة. تتبع التفاعلات الكيميائية الاتجاه العام للتحرك نحو طاقة أقل ، ولكن غالبًا ما يكون لها حاجز في مكانه يجب التغلب عليه. يكمن سر العمل التحفيزي في تقليل حجم هذا الحاجز.

الشكل 4.1 - تحسين معدل للعديد من الإنزيمات صورة Aleia Kim

قبل مناقشة الإنزيمات ، من المناسب التوقف ومناقشة مفهوم مهم يتعلق بالتفاعلات الكيميائية / الكيميائية الحيوية. هذا المفهوم حالة توازن وغالبا ما يساء فهمها. الجزء & ldquoequi & quot من الكلمة يتعلق بالمساواة ، كما قد يتوقع المرء ، لكنه لا يتعلق بالتركيزات المطلقة. ما يحدث عندما يكون التفاعل الكيميائي الحيوي في حالة توازن هو أن تركيزات المواد المتفاعلة والمنتجات لا تتغير بمرور الوقت. هذا لا يعني أن ردود الفعل قد توقفت. تذكر أن التفاعلات قابلة للعكس ، لذلك هناك تفاعل أمامي ورد فعل عكسي: إذا كان لديك 8 جزيئات من A ، و 4 من B في البداية ، وجزيئين من A تم تحويلهما إلى B ، بينما تم تحويل جزيئين من B في وقت واحد بعد تحويله مرة أخرى إلى A ، يظل عدد جزيئات A و B دون تغيير ، أي أن التفاعل في حالة توازن. ومع ذلك ، ستلاحظ أن هذا لا يعني أن هناك أعدادًا متساوية من جزيئات A و B.


ما هي المحفزات؟

المحفزات ليس لها تأثير على ثابت التوازن وبالتالي على تركيبة التوازن. المحفزات هي مواد تسرع التفاعل ولكنها لا تستهلكها ولا تظهر في معادلة التفاعل الصافي. أيضا & [مدش] وهذا مهم جدا و [مدش] العوامل الحفازة تؤثر على المعدلات الأمامية والعكسية بالتساوي هذا يعني أن المحفزات ليس لها تأثير على ثابت التوازن وبالتالي على تكوين حالة التوازن. وبالتالي يمكن استخدام محفز (في هذه الحالة ، حمض الكبريتيك) لتسريع تفاعل قابل للعكس مثل تكوين الإستر أو عكسه ، التحلل المائي للإستر:

الشكل ( PageIndex <1> ): تفاعلات حمض محفز

المحفز ليس له تأثير على ثابت التوازن أو اتجاه التفاعل. يمكن التحكم في الاتجاه عن طريق إضافة الماء أو إزالته (مبدأ Le Chatelier).

تعمل المحفزات من خلال السماح للتفاعل بالحدوث من خلال آلية بديلة تتطلب طاقة تنشيط أصغر. يحدث هذا التغيير من خلال تفاعل محدد بين المحفز ومكونات التفاعل. سوف تتذكر أن ثابت المعدل للتفاعل هو دالة أسية لطاقة التنشيط ، لذلك حتى التخفيض المتواضع لـ (E_a ) يمكن أن يؤدي إلى زيادة رائعة في المعدل.

توفر المحفزات مسارات تفاعل بديلة

تنقسم المحفزات تقليديًا إلى فئتين: متجانس و غير متجانسة. الانزيمات، المحفزات البيولوجية الطبيعية ، غالبًا ما يتم تضمينها في المجموعة السابقة ، ولكن نظرًا لأنها تشترك في بعض الخصائص ولكن تظهر بعض الخصائص الخاصة جدًا الخاصة بها ، فسوف نتعامل معها هنا كفئة ثالثة.


يسلط الضوء

السيتوكرومات P450 عبارة عن إنزيمات منتشرة في كل مكان تقبل عددًا هائلاً من الركائز وتحفز مجموعة واسعة من التفاعلات مع التطبيقات المحتملة في التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية.

تم تصميم P450s لتحفيز التفاعلات اللاأحيائية مثل نقل الكاربين أو النيترين ، مما يفتح آفاقًا جديدة تمامًا في الكيمياء الاصطناعية.

في الآونة الأخيرة ، تم إدخال P450s بنجاح في شلالات متعددة الإنزيمات الاصطناعية ، على حد سواء في المختبر و في الجسم الحي، مما يوفر طرقًا بديلة للإنتاج التخليقي الرجعي للمركبات المؤكسجة عالية القيمة.

يوفر تسخير الإمكانات التركيبية لـ P450s في العمليات الأنزيمية الكيميائية أو كجزء من مسارات التخليق الحيوي المعاد تشكيلها في العوائل الميكروبية استراتيجيات واعدة من جديد توليف التركيبات والمنتجات الطبيعية المعقدة ، على الرغم من أنه لا تزال هناك بعض العقبات التي يجب التغلب عليها.

Cytochromes P450 (P450 أو CYP) عبارة عن إنزيمات تحتوي على الهيم والتي تحفز إدخال ذرة واحدة من الأكسجين الجزيئي في روابط C-H غير المنشطة ، غالبًا بطريقة انتقائية وضوئية. هذه القدرة ، جنبًا إلى جنب مع عدد هائل من الركائز المقبولة ، تجعل من P450s محفزات حيوية قوية. بعد ستين عامًا من اكتشافها ، تم التعرف على أنظمة P450 باعتبارها طوبًا حيويًا أساسيًا في مناهج البيولوجيا التركيبية لتمكين إنتاج جزيئات معقدة عالية القيمة في المضيفات المؤتلفة. أدت النتائج المثيرة للإعجاب الحديثة في هندسة البروتين إلى إنتاج P450 بخصائص مخصصة يمكنها حتى تحفيز التفاعلات اللاأحيائية. يقدم إدخال P450s في تفاعلات شلال متعددة الأنزيمية وعمليات كيميائية إنزيمية منظورات مستقبلية مثيرة للوصول إلى مركبات جديدة لا يمكن تصنيعها بواسطة الطبيعة أو الطرق الكيميائية.


هيكل ووظيفة الإنزيمات

ما هي الانزيمات وماذا تفعل في اجسادنا؟ الإنزيمات هي في الأساس بروتينات تنتجها الكائنات الحية لإحداث تفاعلات أيضية وكيميائية حيوية في الجسم. إنها محفزات بيولوجية تسرع التفاعلات داخل الجسم.

ما هو هيكل الانزيم؟

الإنزيمات ، كما ذكر أعلاه ، هي محفزات بيولوجية. بينما يقومون بتسريع أو تسريع العملية ، فإنهم في الواقع يوفرون مسارًا بديلاً للعملية. ولكن ، في هذه العملية ، هيكل أو تكوين الانزيمات تبقى دون تغيير.

تتكون الإنزيمات بالفعل من آلاف الأحماض الأمينية المرتبطة بطريقة معينة لتشكيل إنزيمات مختلفة. يتم طي سلاسل الإنزيم لتشكيل أشكال فريدة وهذه الأشكال هي التي تزود الإنزيم بخصائصه الكيميائية المحتملة. تحتوي معظم الإنزيمات أيضًا على مكون غير بروتيني يُعرف بالعامل المساعد.

ترتبط وظيفة الإنزيم ارتباطًا جوهريًا بهيكله ثلاثي الأبعاد ، مما يحدد كيفية قيامه بربط الركيزة والتحفيز والتنظيم. تعد دراسة البلورات بالأشعة السينية أهم تقنية في تطوير فهمنا لبنية الإنزيم ووظيفته. تم استخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أيضًا بنجاح لدراسة العديد من الهياكل ، ولكن يظل علم البلورات هو التقنية الأساسية لتوضيح الهيكل. كان أول إنزيم تمت بلورته وتم حل بنيته بنجاح هو ليزوزيم بيض الدجاج في عام 1965. والأهم من ذلك ، بالإضافة إلى بنية الإنزيم الحر ، كان من الممكن بلورة الليزوزيم باستخدام نظير ركيزة مرتبط في الموقع النشط. سمح هذا الهيكل باقتراح آلية كيميائية للإنزيم ، بناءً على وضع المجموعات حول موقع انقسام الركيزة. ساعد استخدام الهياكل البلورية مع نظائرها من الركيزة والحالة الانتقالية في الكشف عن الآليات التحفيزية لعدد لا يحصى من الإنزيمات منذ ذلك الحين.

المجالات

تميل البروتينات الأكبر حجمًا إلى الثني في سلسلة من المجالات الأصغر ، كل منها يشكل وحدة هيكلية قائمة بذاتها. غالبًا ما توصف هذه المجالات على أنها وحدات التطور لأنه يمكن في كثير من الأحيان تبديلها بين البروتينات دون الإخلال بانثناء أجزاء أخرى من البروتين ، وبالتالي يمكن إنشاء وظائف جديدة من خلال مجموعات جديدة من المجالات داخل بروتين واحد. في الإنزيمات ، غالبًا ما يتم احتواء وظائف معينة داخل المجال. على سبيل المثال ، تم العثور على مجال روسمان المرتبط بالنيوكليوتيدات جنبًا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من المجالات التحفيزية المنفصلة ، مما يسمح لكل إنزيم بربط عوامل مساعدة نيوكليوتيد مماثلة مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) ونيكوتيناميد الأدينين فوسفات النوكليوتيد أحادي النوكليوتيد (NADPH) (FMN) ، ولكن تؤدي كيمياء مختلفة تمامًا. يوضح الشكل 1.9 اثنين من الإنزيمات المحتوية على مجال Rossmann: إنزيم نازعة هيدروجين الغليسيرالديهيد -3 فوسفات (GAPDH) و 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR). يحتوي كلا الإنزيمين على مجال Rossmann مع 3 خيوط متوازية مشتركة محاطة بحلزونات α. ترتبط هذه الورقة بالعامل المساعد NAD في حالة GAPDH و NADP في حالة DXR. ما تبقى من بنية الإنزيم والوظيفة غير مرتبط تمامًا ويحتوي على بقايا محفزة مختلفة تمامًا مما يسمح لهم بتحفيز تفاعلاتهم المختلفة.

المواقع النشطة والشقوق

على الرغم من أن الإنزيمات غالبًا ما تكون جزيئات كبيرة تتكون من عدة مئات من الأحماض الأمينية ، إلا أن المناطق الوظيفية للإنزيم تقتصر عمومًا على الشقوق الموجودة على السطح والتي تشكل جزءًا صغيرًا فقط من الحجم الكلي للإنزيم. أهم هذه المناطق هو الموقع النشط & # 8211 الجيب أو الشق الذي يربط فيه الإنزيم الركيزة والذي يتم فيه إجراء الكيمياء التحفيزية للإنزيم. أظهر تحليل بنية الإنزيم ووظيفته أن المواقع النشطة تميل إلى أن تتشكل من أكبر شق على سطح البروتين.

يحفز Phosphofructokinase الفسفرة لـ Dfructose 6-phosphate ، مما يحول ATP إلى ADP في هذه العملية. يتم تنظيمه عن طريق ربط ATP بموقع خيفي ، متميز تمامًا عن الموقع النشط ، والذي يثبط الإنزيم. هذه الشقوق التنظيمية بالإضافة إلى القدرة على ربط الجزيئات التنظيمية ، تتطلب أيضًا القدرة على نقل معلومات الربط من نفسها إلى الموقع النشط ، بحيث يمكن تنظيم النشاط التحفيزي.

كيف تعمل الانزيمات؟

لكي يحدث أي تفاعل في الكون ، هناك حاجة للطاقة. في الحالات التي لا تتوفر فيها طاقة تنشيط ، يلعب المحفز دورًا مهمًا لتقليل طاقة التنشيط وترحيل التفاعل. هذا يعمل أيضًا في الحيوانات والنباتات. تساعد الإنزيمات في تقليل طاقة التنشيط للجزيئات المعقدة في التفاعل. تعمل الخطوات التالية على تبسيط كيفية عمل الإنزيم لتسريع التفاعل:

الخطوة 1: يحتوي كل إنزيم على "موقع نشط" حيث يمكن لأحد جزيئات الركيزة الارتباط به. وهكذا ، يتم تشكيل مركب الركيزة الإنزيمية.

الخطوة 2: يتفاعل جزيء الركيزة الإنزيمية الآن مع الركيزة الثانية لتشكيل المنتج ويتم تحرير الإنزيم كمنتج ثانٍ.

هناك العديد من النظريات التي تشرح كيفية عمل الإنزيمات. ولكن ، هناك نوعان من النظريات الهامة التي سنناقشها هنا.

النظرية 1: فرضية القفل والمفتاح

هذه هي أكثر نظريات عمل الإنزيم قبولًا.

تنص هذه النظرية على أن الركيزة تتناسب تمامًا مع الموقع النشط للإنزيم لتشكيل مركب ركيزة إنزيم. يصف هذا النموذج أيضًا سبب كون الإنزيمات محددة جدًا في عملها لأنها خاصة بجزيئات الركيزة.

النظرية 2: فرضية الملائمة المستحثة

هذا مشابه لفرضية القفل والمفتاح. تقول أن شكل جزيء الإنزيم يتغير كلما اقترب من جزيء الركيزة بطريقة تجعل جزيء الركيزة يتناسب تمامًا مع الموقع النشط للإنزيم.


هيكل العتائق وحقيقية النواة RPRs

على الرغم من عدم توفر هياكل عالية الدقة لـ RPRs الأثرية وحقيقية النواة ، إلا أن تحديد ما لا يقل عن 50 تسلسلًا من كل مجال قد سمح بتحليل تسلسل الجينات الوراثي الذي سمح بدوره بتحسين نماذج البنية الثانوية (Harris et al. 2001 Li and Altman 2004a Marquez et آل 2005). على الرغم من الانخفاض الملحوظ في حجم RPRs البدائية وحقيقية النواة (على الأقل 10 & ndash20 ٪ أصغر من RPRs البكتيرية النموذجية) ، يتم حفظ 13 نيوكليوتيدًا عالميًا في الهوية وربما في الموقع المكاني. من حيث الاختلافات ، تفتقد RPRs البدائية وحقيقية النواة بوضوح بعض عناصر التسلسل / البنية الموجودة في RPR البكتيرية والتي تعتبر إما مهمة لجهات الاتصال من الدرجة الثالثة أو للتفاعلات المباشرة مع الركيزة (الشكل 1). على سبيل المثال ، الاتصالات الثالثة في الطبقة الأصغر 2 من RPR البكتيرية (بين P8 و L14 / L18) غير ممكنة في RPR البدائية أو حقيقية النواة لأنها تفتقر إلى هذه العناصر والزخارف الهيكلية التعويضية ليست واضحة. الحلقة L15 التي تتزاوج القاعدة مع تسلسل CCA في الطرف 3 & الأساسي من ptRNAs غائبة أيضًا في جميع الكائنات حقيقية النواة وبعض RPRs البدائية.


خصوصية أسيل الإنزيم الموسع لـ GCN5

كشفت التطورات الحديثة في علم البروتينات أن بقايا اللايسين على الهيستونات والبروتينات غير الهيستون يمكن أن تخضع لأشكال أخرى من الأسيلة ، بما في ذلك البروبيونيل ، البوتير ، السكسينات ، الارتباط بالجلوتريلي ، الارتباط بالالونيل ، الارتباط بالكروتونات ، وبيتا-هيدروكسي بوتريل [57 ، [70] ، [71] ، [72]]. تشير البيانات الحالية إلى أن إضافة هذه التعديلات اللاحقة للترجمة يتم تحفيزها بواسطة HATs وتخضع للتنظيم الأيضي بناءً على مستويات acyl-CoA الخلوية.


قياس السرعة الأولية لتفاعل كيميائي (مع رسم بياني)

لقياس سرعة التفاعل ، من الضروري اتباع إشارة تبلغ عن تكوين المنتج أو نضوب الركيزة بمرور الوقت.

يختلف نوع الإشارة المتبعة من مقايسة إلى أخرى ولكنها تعتمد عادةً على بعض الخصائص الفيزيائية والكيميائية الفريدة للركيزة أو المنتج ، و / أو قدرة المحلل على فصل الركيزة عن المنتج.

بشكل عام ، تعتمد معظم فحوصات الإنزيم على واحدة أو أكثر من الفئات العريضة التالية من طرق الكشف والفصل لمتابعة مسار التفاعل:

الفصل الكروماتوجرافي و

الفحص المباشر:

يمكن استخدام هذه الطرق في الفحص المباشر ، أو القياس المباشر للركيزة أو تركيز المنتج كدالة للوقت. على سبيل المثال ، يحفز إنزيم السيتوكروم سي أوكسيديز أكسدة البروتين المحتوي على الهيم السيتوكروم ج. في شكله المنخفض (الحديدوز) ، يعرض السيتوكروم ج نطاق امتصاص قوي عند 550 نانومتر ، والذي يتضاءل بشكل كبير في شدته عندما يتأكسد حديد الهيم (شكل حديدي) بواسطة أوكسيديز.

وبالتالي يمكن قياس التغير في امتصاص الضوء عند 550 نانومتر لمحلول السيتوكروم الحديدي كدالة للوقت بعد إضافة أوكسيديز السيتوكروم ج ، فإن تناقص الامتصاص عند 550 نانومتر الذي يتم ملاحظته هو مقياس مباشر لفقدان الركيزة ( تركيز السيتوكروم الحديدي ج) (الشكل 7.1).

في بعض الحالات ، لا توفر الركيزة ومنتج التفاعل الإنزيمي إشارة واضحة للقياس الملائم لتركيزاتها. ومع ذلك ، في كثير من الأحيان ، يمكن أن يقترن توليد المنتج بتفاعل آخر غير إنزيمي ينتج عنه إشارة ملائمة ، ويشار إلى هذه الاستراتيجية على أنها اختبار غير مباشر.

فحوصات غير مباشرة:

يوفر نازعة هيدروجين ثنائي هيدرووروتات (DHODase) مثالاً على استخدام المقايسات غير المباشرة. يحفز هذا الإنزيم تحويل ثنائي هيدرووروتات إلى حمض أوريوتيك في وجود العامل المساعد الخارجي يوبيكوينون. أثناء دوران الإنزيم ، يتم نقل الإلكترونات الناتجة عن تحويل ثنائي هيدرووروتات إلى حمض أروتيك بواسطة إنزيم القالب إلى عامل مساعد يوبيكوينون لتكوين ubiquinol.

من الصعب قياس هذا التفاعل مباشرة ، ولكن يمكن أن يقترن اختزال يوبيكوينون بتفاعلات الأكسدة والاختزال غير الأنزيمية الأخرى. من المعروف أن العديد من الأصباغ النشطة في الأكسدة والاختزال تغير لونها عند الأكسدة أو الاختزال. من بين هؤلاء ، 2 ، 6- ديكلوروفينوليندوفينول (DCIP) هو صبغة مناسبة لمتابعة تفاعل DHODase. في شكله المؤكسد DCIPs أزرق لامع ، يمتص الضوء بقوة عند 610 نانومتر.

عند التخفيض ، يتم فقد شريط الامتصاص هذا تمامًا. يتم تقليل DCIP بطريقة متكافئة بواسطة يوبيكوينول ، والذي يتكون أثناء دوران DHODase. وبالتالي ، من الممكن قياس معدل الدوران الأنزيمي من خلال وجود فائض من DCIP الموجود في محلول من الركيزة (ثنائي هيدرووروتات) والعامل المساعد (يوبيكوينون) ، ثم بعد فقدان امتصاص 610 نانومتر مع مرور الوقت بعد إضافة الإنزيم لبدء التفاعل.

يشار إلى الطريقة الثالثة لمتابعة مسار التفاعل المحفز بالإنزيم باسم طريقة المقايسات المزدوجة. هنا يتم إقران التفاعل الأنزيمي المثير للاهتمام مع تفاعل إنزيمي ثانٍ ، والذي يمكن قياسه بسهولة. في اختبار نموذجي مقترن ، يكون ناتج تفاعل الإنزيم محل الاهتمام هو الركيزة لتفاعل الإنزيم الذي يقترن به من أجل القياس المناسب.

مثال على هذه الاستراتيجية هو قياس نشاط هيكسوكيناز ، الإنزيم الذي يحفز تكوين الجلوكوز 6-فوسفات و ADP من الجلوكوز و ATP. لا يوفر أي من هذه المنتجات أو الركائز وسيلة ملائمة بشكل خاص لقياس النشاط الأنزيمي.

ومع ذلك ، فإن منتج الجلوكوز 6-فوسفات هو الركيزة لإنزيم الجلوكوز 6-فوسفات ديهيدروجينيز ، والذي ، في وجود NADP ، يحول هذا الجزيء إلى 6-فوسفوجلوكونولاكتون. في سياق التفاعل الأنزيمي الثاني ، يتم تقليل NADP إلى NADPH ، ويمكن مراقبة تقليل العامل المساعد بسهولة عن طريق امتصاص الضوء عند 340 نانومتر.

يمكن تعميم هذا المثال على المخطط التالي:

حيث A هي الركيزة لتفاعل الفائدة ، v1 هي سرعة هذا التفاعل ، B هي ناتج تفاعل الاهتمام وكذلك الركيزة لتفاعل الاقتران ، v2 هي سرعة تفاعل الاقتران ، و C هي نتاج تفاعل الاقتران الذي يتم قياسه. على الرغم من أننا نقيس C في هذا المخطط ، إلا أنها سرعة الحالة المستقرة v1 التي نرغب في دراستها.

لتحقيق ذلك ، يجب أن نحقق موقفًا يكون فيه v1 هو الحد من المعدل (على سبيل المثال ، v1 الخامس2) و B وصلت إلى حالة تركيز ثابتة. في ظل هذه الظروف ، يتم تحويل B إلى C بشكل فوري تقريبًا ، ومعدل إنتاج C هو انعكاس لـ v1. سيكون المعدل المقاس أقل من معدل الحالة المستقرة v1، ومع ذلك ، حتى يصل [B] إلى مستوى حالته المستقرة.

ومن ثم ، في أي مقايسة مقترنة ستكون هناك مرحلة تأخر قبل إنتاج الحالة المستقرة لـ C (الشكل 7.2) ، والتي يمكن أن تتداخل مع قياس السرعة الأولية. وبالتالي لقياس السرعة الأولية الحقيقية لتفاعل الفائدة ، يجب البحث عن شروط لتقليل مرحلة التأخر التي تسبق تكوين منتج الحالة المستقرة ، ويجب توخي الحذر لضمان قياس السرعة أثناء مرحلة الحالة المستقرة.

سرعة التفاعل المقترن ، v2، يتبع حركية Michaelis-Menten البسيطة على النحو التالي:

أين ك 2 م يشير إلى ثابت Michaelis للإنزيم E.2، وليس مربع K.م. في وقت مبكر من رد الفعل ، v1 ثابت لتركيز ثابت من E1. ومن ثم ، فإن معدل تكوين B يتم الحصول عليه من خلال:

تم تقييم هذه المعادلة من خلال التكامل بواسطة Storer و Cornish-Bowden (1974) ، الذي أظهر أن الوقت اللازم لـ [B] للوصول إلى نسبة مئوية من مستوى الحالة المستقرة [B]ss يمكن تعريفه بالمعادلة التالية:

اين99% هو الوقت المطلوب لكي تصل [B] إلى 99٪ [B]ss و Ф هي قيمة بلا أبعاد تعتمد على النسبة v1/الخامس2 و v2/الخامس1. من المعروف أن السرعة القصوى V2 هو نتاج kقط لانزيم الاقتران وتركيز انزيم الاقتران [E.2]. قيم kقط وكم لأنزيم الاقتران ثوابت لا يمكن تعديلها تجريبياً دون تغييرات في ظروف التفاعل.

السرعة القصوى V2ومع ذلك ، يمكن للباحث التحكم فيه عن طريق تعديل التركيز [E2]. وبالتالي عن طريق تفاوت [E.2] يمكن للمرء أن يعدل V.2، ومن هنا جاءت النسبة v1/الخامس2، وكذلك زمن التأخر للتفاعل المزدوج.

لنفترض أنه يمكننا قياس سرعة الحالة المستقرة الحقيقية v1 بعد أن وصلت [B] إلى 99٪ من [B]ss. كم من الوقت مطلوب لتحقيق هذا المستوى من [B]ss؟ يمكننا حساب هذا إذا عرفنا قيم v1 و Ф. قام Storer و Cornish-Bowden بجدولة النسب v1/الخامس2 التي تنتج قيمًا مختلفة لـ للوصول إلى نسب مختلفة من [B]ss. يسرد الجدول 7.1 قيم [B] = 99٪ [B]ss.

تعتبر هذه النسبة عادة مثالية لقياس v1 في الفحص المزدوج. في بعض الحالات يمكن تخفيف هذا الشرط. على سبيل المثال ، [ب] = 90٪ [ب]ss سيكون مناسبًا لاستخدام مقايسة مقترنة لفحص كسور العمود بحثًا عن وجود الإنزيم محل الاهتمام.

في هذه الحالة ، لا نحاول تحديد المعلمات الحركية ، لكننا نرغب فقط في قياس نسبي لتركيز الإنزيم الأولي بين العينات المختلفة. يجب على القارئ الرجوع إلى الورقة الأصلية بواسطة Storer and Cornish-Bowden (1974) للحصول على جداول إضافية من Ф لنسب مختلفة من [B]ss.

قدم Easterby (1973) و Cleland (1979) طريقة مختلفة قليلاً لتحديد مدة مرحلة التأخر للتفاعل المزدوج. من علاجاتهم ، نجد أنه طالما أن إنزيم (إنزيمات) الاقتران يعمل في ظل ظروف من الدرجة الأولى (على سبيل المثال ، [B]ss & lt & lt K 2 م) ، يمكننا أن نكتب:

أين τ هو وقت التأخر. الوقت اللازم [B] للاقتراب من [B]ss يرتبط ارتباطًا وثيقًا بـ τ بحيث تكون [B] 92٪ [B]ss عند 2.5 درجة مئوية ، 95٪ [ب]ss في 3τ و 99٪ [B]ss في 4.6 درجة (إيستربي ، 1973). يعتمد تكوين المنتج (C) كدالة للوقت (t) على السرعة الأولية ووقت التأخر (τ) على النحو التالي:

إذا تم استخدام أكثر من إنزيم في خطوات الاقتران ، فيمكن حساب وقت التأخير الإجمالي على أنه ∑ (K i م/الخامسأنا). على سبيل المثال ، إذا استخدم المرء أنزيمي اقتران متتاليين ، A و B لمتابعة رد فعل الإنزيم الأساسي ذي الاهتمام ، فسيتم إعطاء وقت التأخير الإجمالي من خلال:

نظرًا لأن التفاعلات المقترنة تستلزم إنزيمات متعددة ، فإن هذه المقايسات تقدم عددًا من المشكلات المحتملة التي لا تتم مواجهتها مع المقايسات المباشرة أو غير المباشرة. على سبيل المثال ، للحصول على بيانات ذات مغزى عن الإنزيم ذي الأهمية في المقايسات المزدوجة ، من الضروري أن يظل رد فعل الفائدة محددًا للمعدل في ظل جميع ظروف التفاعل.

خلاف ذلك ، فإن أي تغييرات في السرعة تصاحب التغيرات في ظروف التفاعل قد لا تعكس بدقة التأثيرات على الإنزيم المستهدف. على سبيل المثال ، لاستخدام مخطط تفاعل مقترن لتحديد kقط وكم بالنسبة للإنزيم الأساسي ذي الاهتمام ، من الضروري التأكد من أن v1 لا يزال يحد من المعدل عند أعلى قيم لـ [A] (أي الركيزة للإنزيم الأولي للفائدة).

الفحص المقترن:

قد يبدو أيضًا استخدام المقايسة المزدوجة لدراسة تثبيط الإنزيم الأولي مشكلة. يمكن أن يؤدي وجود إنزيمات متعددة إلى غموض في تفسير نتائج مثل هذه التجارب: على سبيل المثال ، ما هو الإنزيم (الإنزيمات) الذي يتم تثبيطه بالفعل؟ يشير إيستربي (1973) ، مع ذلك ، إلى أن استخدام المقايسات المزدوجة لفحص المثبطات يجعل من السهل نسبيًا التمييز بين مثبطات الإنزيم الأولي وإنزيم (إنزيمات) الاقتران.

مثبطات الإنزيم الأساسي سيكون لها تأثير تقليل سرعة الحالة المستقرة v1 (الشكل 7.3 أ) ، في حين أن مثبطات إنزيم (إنزيمات) الاقتران قد تمدد مرحلة التأخر دون التأثير على v1 (الشكل 7.3 ب). من الناحية العملية ، تكون هذه الفروق واضحة فقط عندما يقيس المرء تكوين المنتج على مدى مجموعة من النقاط الزمنية التي تغطي أجزاء كبيرة من كل من مرحلة التأخر ومرحلة الحالة المستقرة لمنحنيات التقدم (الشكل 7.3). رودولف وآخرون. (1979) و Cleland (1979) و Tipton (1992) يقدمان مناقشات أكثر تفصيلاً حول فحوصات الإنزيم المقترن.


الملخص

إن أبسط طريقة لوصف تأثير الانتشار النسبي للمواد المتفاعلة على المسار الزمني للتفاعلات ثنائية الجزيء هي تعديل أو إعادة تطبيع ثوابت المعدل الظاهراتية التي تدخل في معادلات معدل الخواص الحركية الكيميائية التقليدية. ومع ذلك ، بالنسبة للجزيئات الكبيرة ذات المواقع التفاعلية المتعددة غير المتكافئة ، لم يعد هذا كافياً ، حتى في حدود التركيز المنخفض. السبب المادي هو أن إنزيمًا (أو ليجندًا) تم تعديله للتو (أو انفصل عن) أحد المواقع يمكن أن يرتبط بموقع مجاور بدلاً من أن ينتشر بعيدًا. لم يتم وصف هذه العملية بواسطة الحركية الكيميائية التقليدية ، وهي صالحة فقط في الحد الذي يكون فيه الانتشار سريعًا مقارنة بالتفاعل. باستخدام نموذج انتشار رد فعل متعدد الجسيمات قابل للحل تمامًا ، نظهر أن تأثير الانتشار على حركية الارتباط والحفز متعدد المواقع يمكن تفسيره ليس فقط من خلال قياس المعدلات ، ولكن أيضًا عن طريق إدخال وصلات جديدة في المخطط الحركي. تبين أن ثوابت المعدل التي تصف هذه التحولات الجديدة أو قنوات التفاعل لها تفسير فيزيائي شفاف: يتم قياس المعدلات الكيميائية من خلال الاحتمالات المناسبة التي يرتبط بها زوج من المواد المتفاعلة ، والتي تكون في البداية على اتصال ، بدلاً من أن تنتشر عن بعضها. يتم توضيح النظرية من خلال التطبيق على فسفرة ركيزة متعددة المواقع.

بالنسبة للتفاعلات ثنائية الجزيئات في المحلول ، فإن شكليات الحركية الكيميائية صالحة فقط في الحد الذي تتجمع فيه المواد المتفاعلة عدة مرات قبل التفاعل. هذا يعني أن معدل التفاعل الجوهري يجب أن يكون أبطأ من المعدل الذي ينتشر به الشركاء معًا. بدءًا من العمل الأساسي لـ Smoluchowski (1) ، فقد تبين أن الانتشار النسبي للمواد المتفاعلة ، حتى في محلول متجانس عيانيًا ، يمكن أن يؤدي إلى انحرافات عن تنبؤات الحركية الكيميائية التقليدية. على سبيل المثال ، بالنسبة للتفاعلات القابلة للانعكاس ، تتحلل التركيزات إلى قيم توازنها ليس بشكل أسي ، بل كقانون قوة (2 ، 3). ومع ذلك ، بالنسبة للتركيزات ذات الصلة من الناحية الكيميائية الحيوية ، فإن هذه التأثيرات صغيرة. حتى في البيئة المزدحمة للخلية ، على الرغم من أن التركيز الكلي لجميع الجزيئات الكبيرة مرتفع بالطبع ، إلا أن تركيزات جزيئات معينة يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض تكون منخفضة عادةً. على الرغم من أنه من المثير للاهتمام والتحدي تطوير نظرية للتفاعلات القابلة للانعكاس المتأثرة بالانتشار والتي تكون دقيقة في جميع الأوقات والتركيزات ، في كثير من الحالات تكون التركيزات منخفضة جدًا لدرجة أن كل ما يتعين على المرء فعله هو استبدال ثوابت معدل الظواهر بانتشارها- القيم المتأثرة.

في هذا البحث ، نأخذ في الاعتبار فئة من التفاعلات التي تتضمن جزيئات كبيرة ذات مواقع متعددة ، حيث لا يكفي ، حتى عند التركيزات المنخفضة ، استبدال ثوابت المعدل بأخرى متأثرة بالانتشار. تم تحفيز اهتمامنا بمثل هذه المشكلات من خلال العمل المهم الذي قام به تاكاهاشي وآخرون. (4) حول دور الانتشار في دورة الفسفرة المزدوجة - نزع الفسفرة التي يمكن أن تظهر سلوكًا شديد الحساسية (5) وسلوكًا ثابتًا (6). استنادًا إلى عمليات المحاكاة العشوائية للعديد من الجسيمات ، تبين أن إبطاء الانتشار يمكن أن يسرع الاستجابة ويؤدي إلى فقدان الحساسية الفائقة والثباتية (4). تُعزى هذه النتائج إلى "الارتباطات المكانية والزمانية بين الإنزيم وجزيئات الركيزة." يتم توضيح الفكرة المادية في الشكل 1 للفسفرة المزدوجة. من أجل البساطة ، افترضنا أن مواقع الربط والحفز هي نفسها واعتمدنا إطارًا مرجعيًا حيث تم إصلاح الركيزة. بعد تعديل الموقع الأول ، ينفصل الإنزيم و (أنا) ينتشر بعيدًا ويرتبط إنزيم آخر ويعدل الموقع الثاني (المسار السفلي) أو (ثانيا) يرتبط بالموقع الثاني ويعدله (المسار العلوي). بمعنى آخر ، في المسار العلوي ، يتم فسفرة كلا الموقعين بواسطة نفس جزيء الإنزيم ، بينما في المسار السفلي ، يتم فسفرة المواقع بواسطة جزيئات مختلفة. في حد الانتشار السريع ، لا يتم تشغيل سوى المسار السفلي. في مجال الفسفرة ، تسمى الآلية التوزيعية عندما ينفصل الإنزيم والركيزة بعد كل تعديل ، بينما في آلية المعالجة يتم فسفرة جميع المواقع قبل التفكك (7 ، 8). وهكذا ، عندما يكون معدل الانتشار محدودًا ، فإن الآلية تحتوي حتمًا على كل من السمات التوزيعية والمعالجة (4 ، 9 ، 10).

ركيزة س مع موقعين (أصفر) يمكن تعديلهما (أحمر) بواسطة إنزيم ه عند التركيز [ه]. المسار السفلي: بعد تعديل أحد المواقع ، ينتشر الإنزيم بعيدًا ويربط إنزيم آخر الموقع غير المعدل ويفسفه. المسار العلوي: ينفصل الإنزيم الذي قام بتعديل موقع واحد للتو ، ويرتبط بالموقع غير المعدل ، ثم يقوم بفسفرته.

الهدف من هذه الورقة هو تطوير نظرية بسيطة يمكن أن تصف كميًا مثل هذه الظواهر لنطاقات التركيز ذات الصلة جسديًا دون الحاجة إلى اللجوء إلى عمليات محاكاة الكمبيوتر متعددة الجسيمات. باختصار ، لا يحتاج المرء فقط إلى استبدال ثوابت المعدل الظاهراتي الحالية بنظرائهم المتأثرين بالانتشار ، ولكن يتعين أيضًا على المرء إدخال انتقالات جديدة في المخطط الحركي. يتم تحديد معدلات قنوات التفاعل الجديدة هذه من خلال احتمال ارتباط المادة المتفاعلة المنبعثة من موقع بآخر بدلاً من الانتشار بعيدًا. حتى بالنسبة للهندسات المعقدة ، يمكن العثور على احتمالات الالتقاط والهروب من خلال الحل العددي أو محاكاة مشكلة ثنائية الجسيم مستقلة عن الوقت فقط.

الخطوط العريضة للورقة على النحو التالي. نبدأ بأبسط نموذج تعديل متعدد المواقع يمكن حله بالضبط على مستوى الجسيمات المتعددة. في هذا النموذج ، يُفترض أن عمر مركب الركيزة الإنزيمي قصير جدًا بحيث يمكن تعديل الموقع عندما يتلامس الإنزيم ببساطة مع الركيزة. عندما يكون تركيز الإنزيم منخفضًا بما فيه الكفاية ، وجد أن الاعتماد الدقيق للوقت للتركيزات موصوف جيدًا بواسطة معادلات المعدل العادي المقابلة لمخطط الحركية القياسي مع الاختلاف الحاسم الذي يسمح بالتحولات الجديدة. تبين أن ثوابت المعدل المقابلة لها تفسير مادي بسيط بحيث يمكن تعميم الشكلية بسهولة لمعالجة الحالات الأكثر واقعية (على سبيل المثال ، المجمعات المتوسطة ، وإعادة تنشيط الإنزيم ، والربط بالمواقع غير المتكافئة). يمكن التعبير عن ثوابت المعدل في المخططات الحركية المعدلة من حيث احتمالات الالتقاط والهروب لزوج معزول من المواد المتفاعلة. في الحالات البسيطة ، يمكن العثور على هذه من خلال حل معادلة مستقلة عن الوقت تخضع لشروط الحدود المناسبة ، ولأشكال هندسية واقعية ، عن طريق محاكاة ديناميكيات زوج معزول من المواد المتفاعلة. تظهر الحسابات التوضيحية للفسفرة المزدوجة أن الشكليات لدينا تعيد إنتاج تسريع الاستجابة المكتشفة باستخدام محاكاة عشوائية للعديد من الجسيمات (4).


استنتاج

Science is difficult, but the satisfaction of reaching some new understanding of the extraordinary chemical and physical processes that are responsible for the functioning of a living organism, whether it be an amoeba or an Einstein, is a more than adequate incentive to pursue this understanding, which has undergone an extraordinary increase during my lifetime. The progress that has been made in increasing this understanding has gone far beyond what was thought possible in the 1960s, as is apparent from the reviews that are published in this volume.


شاهد الفيديو: شرح العوامل المؤثرة على عمل الإنزيمات الحرارة وال PH (شهر نوفمبر 2022).